uji kualitatif Karbohidrat

Pada uji kualitatif ini digunakan liver ayam. Liver ini mengandung protein, lemak, dan asam nukleat / nukleotida. Mula-mula liver kita potonong kecil-kecil. Hal ini bertujuan untuk mempermudah reaksi berlangsung. kemudian kita tambahkan TCA. Penambahan TCA pada liver berfungsi untuk melarutkan kandungan protein, lemak, dan asam nukleat sehingga diperoleh glikogennya saja. Setelah itu, divortex untuk menghomogenkan larutan. Lalu disaring dan diambil filtratnya. Setelah itu dilakukan uji kualitatif dengan meneteskan iodine pada filtrate. Ternyata filtrate berubah warna menjadi merah kecoklatan, hal ini menunjukkan glikogen positif mengandung karbohidrat. Glikogen merupakan polisakarida. Polisakarida yang direaksikan dengan larutan iodine akan memberikan warna yang spesifik, yaitu merah kecoklatan. Lalu ditambahkan etanol 95% pada filtrate yang berfungsi untuk mencuci / memisahkan glikogen. Lalu diaduk dengan stirrer untuk menghomogenkan larutan. Setelah itu, ditambahkan sedikit NaCl untuk menimbulkan endapan, lalu disentrifuse untuk memisahkan pellet dan supernatant. Pellet diambil dan ditambahkan ether lalu ditangas pada air mendidih supaya ether menguap dan didapatkan glikogen murni.

Kandungan karbohidrat dalam glikogen secara kuantitatif dapat diukur dengan cara hidrolisis enzimatis oleh enzim α-amilase. Enzim α-amilase menghidrolisa ikatan α (1→4) pada cabang sebelah luar glikogen menghasilkan D-glukosa, sejumlah kecil maltose, dan suatu inti yang tahan hidrolisa yang disebut limit dekstrin. Enzim α-amilase tidak dapat memecahkan ikatan α(1→6) pada ikatan – ikatan cabang sehingga enzim α-amilase tidak menghidrolisa lebih jauh. Enzim α-amilase dapat menghidrolisis glikogen dengan baik pada suhu sekitar 37° atau sama dengan suhu tubuh manusia. Jika berada pada suhu yang lebih tinggi atau lebih rendah, enzim ini akan mengalami kerusakan dan tidak dapat menghidrolisis glikogen.

Reaksi hidrolisis glikogen adalah

(C₆H₁₀O₅)n + n H₂O → n C₆H₁₂O₆

glikogen glukosa

Setelah itu, dilakukan hidrolisis glikogen. Pellet glikogen / glikogen murni ditambah dengan larutan buffer phosphate yang berfungsi untuk mempertahankan pH agar tetap asam. Lalu divortex untuk homogenisasi. Lalu larutan dibagi menjadi 5 tabung dan masing – masing ditambah amylase dan diinkubasi supaya terjadi hidrolisis. Lalu tabung diambil satu per satu dengan interval waktu 10 menit, lalu ditambah DNSA yang berfungsi untukmenghentikan reaksi hidrolisis. Lalu ditangas dalam air mendidih. Setelah itu, diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer.

Pada kurva konversi maltose pada selang waktu terlihat semakin lama waktu pengambilan, semakin besar konversi maltosenya. Hal ini menunjukkan bahwa konversi maltose berbanding lurus dengan selang waktu. Semakin lama waktu, maka semakin banyak glikogen yang diubah menjadi maltose. Namun, pada percobaan, pada selang waktu 50 menit konversi maltose menurun. Hal ini disebabkan reaksi hidrolisis sudah berhenti dan pengubahan glikogen menjadi maltose mulai menurun.