uji kuantatif protein

Pada praktikum tentang uji kuantatif protein ini dilakukan dua kali percobaan, percobaan pertama adalah preparasi ekstrak protein pada tempe dan putih telur. Pada percobaan ini ektrak tempe dan dan putih telur pertama-tama dimasukan kedalam tabung reaksi dengan volume yang sudah ditentukan yaitu 1 ml, kemudian ditambah buffer fosfat sebanyak 25 ml dan divortex supaya kedua larutan tersebut tercampur secara homogen. kemudian diabsorbansi pada spektofotrometri untuk mencari OD yang kemudian OD ini digunakan untuk mencari konsentrasi kedua ekstrak pada kurva standar.
Percobaan yang kedua adalah percobaan penentuan protein secara kuantiitatif. pada percobaan ini digunakan albumin yang dimasukan kedalam 6 tabung reaksi yang diisi dengan volume berbeda, mulai tabung satu yang tidak diiisi samapai tabung yang keenam dengan volume albumin paling banyak. Kemudian setiap tabung diisi akuades sampai volume 2 ml. setelah itu ditambah dengan Reagen D yang telah dibuat terlebih dahulu, dengan pencampuran antara reagen A, B, C dengan volume tertentu, masing-masing divortex dan diinkubasi selama 15 menit. setelah 15 menit masing-masing tabung reaksi ditambah dengan 3 ml reagen E, diinkubasi lagi dan baru akhirnya diabsorbansi dengan spektofotometri dengan panjang gelombang 540 nm. lalu didapat OD-nya.
Percobaan yang kedua banyak melibatkan reagen-reagen, komposisi reagen-reagen itu adalah :
• Reagen A tersusun atas : 100 g Na2CO4 dilarutkan dalam NaOH 0,5 N hingga mencapai volume 1 liter.
• Reagen B tersusun atas : 1 g CuSO45H2O dilarutkan dalam akuadeshinggan mencapai volume 100 ml.
• Reagen C tersusun atas : 2 g K-tartrat dalam 100 ml akuades.
• Reagen D tersusun atas : campuran 15 ml reagen A; 0,75 ml reagen B; dan 0,75 ml reagen C digojog sampai homogen.
• Reagen E tersusun atas : pengenceran 25 ml reagen Folin Ciocalteu 2 N menjadi volume 50 ml dan digojog samapai homogen.
Fingsi dari reagen E atau Folin Ciaoteu pada percobaan adalah merubah larutan dalam tabung menjadi biru, hal ini disebabkan reaksi antara protein dengan cupri ( Cu2+ ) dalam larutan alkalis dan terjadi reduksi garam fosfomiolibdat fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan yang ada pada protein (modul praktikum biokimia).
Pada percobaan uji kualitatif protein terjadi perubahan fisik warna larutan, ketika larrutan sampel ditambah reagen D warna berubah menjadi ungu dengan keterangan seperti pada hasil percobaan diatas, dan terjadi perubahan warna lagi ketika ditmbah dengan reagen E, larutan menjadi warna biru.
sampel yang digunakan adalah tempe dan putih tekur. Pada kedua bahan ini telah diketahui banyak mengandung protein. Pada tempe termasuk protein nabati, sedangkan pada putih telur adalan protein hewani, dimana sarat sampel seperti yang tertera pada tujuan praktikum.
Inkubasi dilakukan agar larutan yang dicampur pada tabung reaksi dapat bercampur atau bereaksi secara homogen sempurna setelah dilakukan vortex. setelah itu dicari OD nya dengan alat spektofotometri karena pada tujuan dan latar belakang praktikum disarankan menggunakan penentuan kualitatif protein dengan metode ini,sedangkan panjang gelombang 540 nm karena protein dapat ditentukan konsentrasinya dengan panjang gelombang standar ini.
Struktur protein dapat dilihat sebagai hirarki, yaitu berupa struktur primer (tingkat satu), sekunder (tingkat dua), tersier (tingkat tiga), dan kuartener (tingkat empat). Struktur primer protein merupakan urutan asam amino penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida (amida). Sementara itu, struktur sekunder protein adalah struktur tiga dimensi lokal dari berbagai rangkaian asam amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen. Berbagai bentuk struktur sekunder misalnya ialah sebagai berikut:
• alpha helix (α-helix, "puntiran-alfa"), berupa pilinan rantai asam-asam amino berbentuk seperti spiral;
• beta-sheet (β-sheet, "lempeng-beta"), berupa lembaran-lembaran lebar yang tersusun dari sejumlah rantai asam amino yang saling terikat melalui ikatan hidrogen atau ikatan tiol (S-H);
• beta-turn, (β-turn, "lekukan-beta"); dan
• gamma-turn, (γ-turn, "lekukan-gamma").
Gabungan dari aneka ragam dari struktur sekunder akan menghasilkan struktur tiga dimensi yang dinamakan struktur tersier. Struktur tersier biasanya berupa gumpalan. Beberapa molekul protein dapat berinteraksi secara fisik tanpa ikatan kovalen membentuk oligomer yang stabil (misalnya dimer, trimer, atau kuartomer) dan membentuk struktur kuartener. Contoh struktur kuartener yang terkenal adalah enzim Rubisco dan insulin ( http://id.wikipedia.org/wiki/ Protein_2009/). Selengkkapnya ada pada dasar teori, sedangkan macam protein ada 2 yaitu protein nabati contonya pada tempe, tahu dan protein hewani contonya pada telur dan daging.
Kurva standar dibentuk dari OD sebagai y dan x adalah volume albumin yang dibagi dengan volume seluruh larutan dalam tabung reaksi hasil pencampuran. setelah ditentukan tabel kurva standarnya barukah kurva dapat digambar pada milimeterblok. Kuva yang terbentuk adalah garis linear. Untuk menentukan persamaan garis kurva dapat ditentukan dengan rumus : Y = a + bX , perhitungan variabel a dan b dapat dilihat pada bagian lampiran dan hasil perhitungan persamaan garisnya Y = 0,0988 + 60,588X. pencarian persamaan garis ini juga dapat dilakukan dengan menggunakan kalkulator graphic untuk mempermudah perhitungan. setelah didapat persamaan garis, maka dapat ditentukan konsentrasi sampelnya dengan rumus X(konsentrasi yang dicari) = (Y – a) / b. Perhitungan ini jga dapat dilihat pada bagian lampiran. Cara lain tanpa menggunakan rumus dapat dilakukan dengan menentukan titik potong OD sampel pada kurva standat yang telah dibentuk, kemudian dari perpotongan itu ditarik pada sumbu x yang menunjukan konsentrasi.